Investigation of the Effect of Reduced MOB2 Expression on the Olaparib Response of PARP1/2 Inhibitor-Resistant Cancer Cells

Abstract

ABSTRACT: PARP enzymes play significant roles in various cellular processes, including DNA single-strand break repair. Inhibition of PARP activity results in the accumulation of DNA single-strand breaks, which are eventually converted to DNA double-strand breaks, especially during DNA replication. Cells with deficient homologous recombination DNA double-strand break repair pathway are hypersensitive to PARP inhibitors due to deleterious accumulation of DNA breaks. Although several PARP inhibitors have been effectively used in the clinic, PARP inhibitor resistance that ultimately develops in most patients limits clinical success. Therefore, identification of pharmacologically important cellular targets and predictive biomarkers may ameliorate the current treatment strategies with PARP inhibitors. hMOB2 protein is a potential DNA damage response regulator that supports homologous recombination repair mechanism. hMOB2-defective cancer cells, thus, become sensitive to PARP inhibition. In this research, it was investigated whether hMOB2 deficiency may also render PARP inhibitor-resistant cancer cells selectively sensitive towards PARP inhibition. Mammalian cell culture and various molecular biology techniques were used to dissect our research questions. U2OS osteosarcoma cancer cells and olaparib, a potent PARP inhibitor widely used in the clinic, were employed in our experiments. U2OS cells were subjected to continuously increased doses of olaparib to establish PARP inhibitor-resistant clones (U2OS/PIR cells). Interestingly, p21 protein levels were dramatically elevated in U2OS/PIR cells compared to parental counterparts, although no difference was observed in p53 and hMOB2 expressions. Notably, hMOB2 silencing significantly reduced the survival of U2OS/PIR cells in the absence of olaparib. Dual inhibition of hMOB2 and PARP activities further sensitized resistant cancer cells towards olaparib treatment. Taken together, our experiments revealed that, against PARP inhibition, hMOB2 protein is likely to be an important factor that supports not only parental cells but also PARP inhibitor-resistant cells to survive.

ÖZET: PARP enzimleri DNA tek zincir kırık onarımı dahil olmak üzere çok sayıda hücresel süreçte rol oynamaktadır. PARP aktivitesinin inhibisyonu, özellikle DNA replikasyonu esnasında DNA çift zincir kırıklarına dönüşen DNA tek zincir kırıklarının birikmesine neden olur. Homolog rekombinasyon DNA çift zincir onarım yolağından yoksun olan kanser hücreleri, DNA kırıklarının tehlikeli birikimlerinden dolayı PARP inhibisyonuna karşı yüksek hassasiyet kazanmaktadır. Çeşitli PARP inhibitörleri klinikte etkili bir şekilde kullanılmasına rağmen, neticede çoğu hastada gelişen PARP inhibitör direnci klinik başarıyı sınırlandırmaktadır. Bu nedenle, farmakolojik olarak önem arz eden çeşitli hücresel hedeflerin ve prediktif biyobelirteçlerin tanımlanması, PARP inhibitörleriyle gerçekleştirilen güncel tedavi stratejilerini güçlendirebilir. hMOB2 proteini, homolog rekombinasyon onarım mekanizmasını destekleyen potansiyel bir DNA hasar yanıt regülatörüdür. Bundan dolayı, hMOB2-defektif kanser hücreleri PARP inhibisyonuna karşı hassas hale gelmektedir. Bu araştırmada, hMOB2 işlevsizliğinin, PARP inhibitör tedavisine dirençli kanser hücrelerini de PARP inhibisyonuna karşı hassas hale getirip getirmeyeceği araştırıldı. Araştırma sorularımızın test edilmesi için memeli hücre kültürü ve çeşitli moleküler biyoloji teknikleri kullanıldı. Deneylerimizde, U2OS osteosarkoma kanser hücreleri ve klinikte yaygın bir şekilde kullanılan PARP inhibitörü olaparib kullanıldı. PARP inhibitörüne dirençli klonların (U2OS/PIR) oluşturulması amacıyla U2OS hücreleri sürekli olarak artan dozlarda olaparib tedavisine maruz bırakıldı. hMOB2 ve p53 ekspresyonlarında bir fark gözlenmemesine rağmen, ilginç bir şekilde, parental hücrelere kıyasla, U2OS/PIR hücrelerinde p21 protein miktarının önemli oranda arttığı gözlendi. Azalan hMOB2 ifadesinin, olaparib tedavisi uygulanmaksızın U2OS/PIR hücrelerinin sağ-kalımını azalttığı belirlendi. hMOB2 ve PARP aktivitelerinin ikili inhibisyonunun, dirençli kanser hücrelerini olaparib tedavisine karşı daha hassas hale getirdiği ortaya çıkarıldı. Sonuç olarak, gerçekleştirdiğimiz deneyler PARP inhibisyonuna karşı, hMOB2 proteininin sadece parental hücrelerin değil aynı zamanda PARP inhibitörüne dirençli kanser hücrelerinin de sağ-kalımını destekleyici bir faktör olabileceğini göstermiştir.