Purification, Characterization and The Effect of Some Drugs on Glutathione S-Transferase (GST) Enzyme From Rat Erythrocyte

Abstract

ABSTRACT: In this study, glutathione S-transferase (GST; EC: 2.5.1.18) enzyme was purified from rat erythrocyte in a single step by glutathione agarose affinity chromatography. The enzyme was purified with 6.3 EU/mg protein specific activity, with 44% recovery and 115 purification fold. The purity of enzyme was detected by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and produced a single protein band with a calculated molecular weight of 25.2 kDa. The characterization studies showed that the optimum pH=8 in potasium phosphate buffer, optimum temperature is 50oC, optimum ionic strength is 0.2M in potasium phosphate and stable pH=8 in potasium phosphate buffer. Kinetic studies performed for calculating KM and Vmax for (GST) using both glutathione (GSH), and 1-chloro 2,4- dinitrobenzene (CDNB) as two subsrates, the obtained results are 1.22 mM and 1.21 EU/mL respectively for GSH 0.374 mM and 3.614 EU/mL respectively for (CDNB). Finally inhibition or activation effect of some drugs on the enzyme activity were studied in vitro. The results proved that buscopan and ampisid were two activators of the enzyme, gentamicin and clindamicin were two inhibitors (IC50 values were found as 1.69 and 6.9 mM respectively and Ki values were found as 1.70 and 2.36 mM respectively), and cefazoline has no effect on the enzyme activity.

ÖZET: Bu çalışmada glutatyon S-transferaz (GST; EC: 2.5.1.18) enzimi, sıçan eritrositlerinden glutatyon agaroz afinite kromatografisi ile tek basamakta 6,3 EU / mg protein spesifik aktivite ile %44 verimle 115 kat saflaştırıldı. Enzimin saflığı, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile tespit edildi.Saf enzimin alt birimlerine ait molekül ağırlığı 25,2 kDa olarak hesaplandı. Sıçan eritrositlerinden saflaştırılan GST enzimi için yapılan karakterizasyon çalışmalarında; optimum pH potasyum fosfat tamponu pH=8, optimum iyonik şiddet potasyum fosfat tamponu 0,2M, optimum sıcaklık 50oC, stabil pH potasyum fosfat tamponu pH=8 olarak belirlendi. Yapılan kinetik çalışmalarsonucunda; GST enzimine ait iki substrat olan glutatyon (GSH) ve 1-kloro- 2, 4-dinitrobenzen (CDNB) için KM ve Vmax değeri sırasıyla GSH için 1,22 mM ve 1,21 EU / mL, CDNB için 0,374 mM ve 3,614 EU / mL olarak bulunmuştur. Son olarak, bazı ilaçların enzim aktivitesi üzerine olan etkileri in vitro olarak çalışıldı. Yapılan çalışmalar sonucunda buscopan ve ampisidin antibiyotiklerinin rat eritrositlerinden saflaştırılan GST enziminin aktivitesini artırdığı, gentamisin ve klindamisin’ antibyotiklerinin, enzim aktivitisini inhibe ettiği (IC50 değerleri sırasıyla 1,69 ve 6,9 mM olarak, Ki değerleri sırasıyla 1,70 ve 2,36 mM bulundu), sefazolin antibiyotiğinin ise enzim aktivitesi üzerinde bir etkisinin olmadığı tespit edildi.