THE EFFECT OF CURCUMIN ON P53 /TIGAR AND AUTOPHAGY PATHWAY IN HUMAN OSTEOSARCOMA U2OS CELL LINE

Abstract

Osteosarcoma is a cancer disease from primitive bone tumor initiation and evolution of tubular long bones include femur, humerus and tibia. Osteosarcoma disease is defined and diagnosed throughout the inspection of tumor osteoblast cells that produce osteoid. Turmeric (Curcuma longa) is the most effective component in dried ground rhizomes of a member Zingiberaceae family. Curcumin have excellent free radical scavenging properties, however curcumin is almost the strongest antioxidant present in turmeric. Turmeric seasonal herbaceous plant with long lateral ramifications originally comes from Southeast Asia. Curcumin properties include anticancer, anti-bacterial, anti-inflammatory and antioxidant. Curcumin as chemical therapeutic agent demonstrated to suppress or inhibit various signaling pathways includes arrest tumor cell proliferation, inducing autophagy or apoptosis, inhibit malignant cell invasion and suppressing inflammatory responses. Despite the fact that effects of curcumin in cancer has been broadly reported, but the weather of curcumin on p53/TIGAR and autophagy has not been addressed in osteosarcoma U2OS cell line. In this present study, we screened the weather of curcumin after treated U2OS cells with curcumin, cultured cell were treated by various concentrations (10, 15, 20 and 25) μMolars curcumin intended for 24h. After cultured and treatment cells proliferation and viability were detected by MTT assay. The expression levels of these proteins (p53, TIGAR, Beclin-1 and LC3) were analyzed by immunoblotting assay and the expression of LC3 protein autophagy marker were analyzed by immunocytochemistry assay. The MTT assay results demonstrated that curcumin lead to distinct suppression of osteosarcoma cell proliferation and cell viability. There were observed a linear dose/depends effect for curcumin range 15-25 μM dose cause to modulate of p53, TIGAR, Beclin1 and LC3. Analysed protein reveals a relation reduction in the levels of p53 and TIGAR proteins above treatment with 10–25 μM curcumin. The result of immunocytochemistry showed that by increasing curcumin dose significantly increased the expression of the total amount LC3 protein in cytoplasm osteosarcoma U2OS cells. Our studied has improved the perceptive of the fundamental technique anticancer properties of curcumin.

Osteosarkom, kemiklerde en sık rastlanan primer tümörlerdir ve genellikle tibia, femur, humerus gibi uzun boru şekilli kemiklerin metafizi çevresinde ortaya çıkar. Curcumin, Curcuma longa L'nin kurutulmuş toprak rizomlarındaki en önemli etkiye sahip bileşendir. Yara iyileşmesini destekler, karaciğer hasarına, katarakt oluşumuna ve pulmoner toksisiteye karşı koruma sağlar. Curcumin (zerdeçal) geleneksel Çin tıbbında binlerce yıldır kullanılmaktadır. Anti-bakteriyel, anti-inflamatuvar, anti-oksidan ve anti-kanser özellikleri de dahil olmak üzere birçok farmakolojik etkiue sahip olduğu bildirilmiştir. Curcumin’in, hücre invazyonunu engellemek, migrasyonu ve inflamatuar yanıtları bastırmak, apoptoz veya otofajiyi tetiklemek birçok etkisinin olduğu kanıtlanmıştır. Kansere karşı curcumin etkilerinin kapsamlı bir şekilde araştırılmış olmasına rağmen curcumin'in p53 / TIGAR ve otofajik yolak üzerindeki etkisi U2OS hücre hattında henüz ele alınmamıştır. Bu nedenle insan osteosarkom U2OS hücre hattında curcuminin p53 / TIGAR ve otofaji yolu üzerindeki etkisininin araştırılması amaçlanmıştır. Osteosarkom U2OS hücreleri 24 saat süreyle farklı konsantrasyonlarda (10, 15, 20 ve 25 μM) curcumin ile tedavi edildi. Hücre çoğalması hücre canlılık testi olan MTT ile saptanmıştır. Bu proteinlerin (p53, TIGAR, Beclin-1 ve LC3) ekspresyon seviyeleri, western blotting ile analiz edilmiştir. MTT analizinin sonuçları, curcumin'in osteosarkom hücre proliferasyonunun ve hücre canlılığının inhibisyonuna neden olduğunu göstermiştir. Curcumin aralığı 15-25 μM doz ve p53, TIGAR, Beclin1 ve LC3 modülasyonu için doza / bağımlı doğrusal bir etkisinin olduğu belirlenmiştir. Osteosarkom U2OS hücre hattı 15-25 uM curcumin ile tedavi edildiğinde p53 ve TIGAR protein seviyelerinde bir düşüş olduğu ortaya konmuştur. Beclin-1'in curcumin tarafından inhibe edilmesi otofajiye spesifik belirteç olan mikrotübüle bağlı protein LC3’nin artmasına yol açmaktadır. Immünositokimya sonucunda curcumin dozunun artmasıyla total LC3 proteininin ekspresyonunun belirgin şekilde arttığı gösterilmiştir. Bu bulgular, curcumin'in antikanser özelliklerinin altında yatan mekanizmanın anlaşılmasını geliştirmiştir.