Determination of Saccharomyces Cerevisiae Resistant to PCM Obtained By İnverse Metabolic Strategy and Trans-Effect of its Metabolites on PC3

Abstract

ABSTRACT: Cancer is a chaotic disease to treat, because of the cell variety and the multiplicity of intracellular pathways that are a major problem to find a simple and definitive solution. Furthermore, in order to investigate an accurate remedy to cancer, it is necessary to know the entire metabolism in detail, but the current level of knowledge and technology are not sufficient for that. Thus, it is required alternative approaches to struggle with cancer-like diseases. In this study; we aimed to use a natural strategy, which is based on to obtain the mutant strain of S.cerevisiae by an in vivo evolutionary engineering, which is able to easily grow in prostate cancer cells (PC3) environment. In addition, the counter effect of DMEMs (Dulbecco's Modified Eagle Medium), fermented with these individual mutants and WT (Wild Type) yeasts, in PC3 cells were assessed by several molecular assays such as cell growth, oxidative injury, cell migration and apoptosis related gene expressions. Evolutionary engineering was applied to WT yeast population, which has the bad growth fitness in PCM (DMEM cultured with PC3 cells). The population treated with a chemical mutagen, EMS (Ethyl Methane Sulfonate), to randomly generate a variety of genetic phenotypes. The best individual mutants with PCM-resistant phenotype were selected with genetic stability assays applied. Additionally, the selected mutants and WT were separately cultivated in DMEM until logarithmic phase to gain a fermented medium. In order to clarify the effects of each DMEM cultured with mutant and WT yeasts (WT-DM, MP-DM, and MY-DM) in PC3 culture were examined by measuring oxidative damage, apoptotic index, cell migration and gene expression assays. According to the findings of the present study, the growth fitness of mutant yeasts dramatically increased in PCM, which compared to WT. Therefore, the randomly EMS-mutagenized population probably consists of the desired colonies that can normally grow in PCM. This study further displayed that WT-DM, MP-DM, and MY-DM significantly decreased cell growth by inducing apoptosis in PC3 cell culture. However, MP-DM increased apoptotic index whereas it was downregulated the expression of apoptotic genes. Unlike WT-DM and MP-DM; MY-DM simultaneously activated many molecular pathways, for instance, elevated ROS production, suppressed cell migration and upregulation of apoptotic gene expressions, to promote apoptosis in PC3 cells. As a conclusion, in order to alter the situation that is the restricted growth of WT in PCM, the current study was successfully applied evolutionary engineering strategies to obtain the desired phenotypes (MY2 and MP2). Moreover, the results indicated that WT-DM and MP-DM, MY-DM include various effective metabolites to induce apoptosis in PC3 cells.

ÖZET: Kanser, kaotik bir rahatsızlıktır, çünkü hücre çeşitliliği ve hücre içindeki yolakların çokluğu, basit ve kesin bir çözüm bulmayı zorlaştırır. Dahası, kansere karşı kesin bir çare bulmak için, metabolizmanın tamamını ayrıntılı olarak bilmek gerekiyor, ancak mevcut bilgi ve teknoloji seviyesi bunun için yeterli değil. Bu nedenle kanser benzeri hastalıklarla mücadele için alternatif yaklaşımlar gereklidir. Bu çalışmada amacımız doğal bir strateji olan evrimsel mühendislik yöntemi ile prostat kanser hücrelerinin kültürlendiği ortamda, kolayca büyüyebilen S. cerevisiae mutant suşu elde etmektir. Buna ek olarak, elde edilen mutant ve WT (doğal şuş) mayalar, DMEM ortamında kültürlenerek fermente besiyerileri elde edildi. Böylece bu fermente DMEM’lerin PC3 hücreleri üzerindeki karşı etkileri oksidatif hasar, hücre göçü, gen ifadesi ve hücre büyümesi gibi birkaç moleküler yöntemle değerlendirildi. Evrimsel mühendislik yaklaşımı, PCM ortamında (PC3 hücreleriyle kültürlenmiş DMEM) iyi büyüyemeyen WT maya popülasyonuna uygulanmıştır. Başlangıç popülasyonunda çeşitlilik oluşturmak için bir kimyasal mutajen olan EMS (Etil metansülfonat) rastgele mutasyon oluşturmak için kullanıldı. Genetik kararlık testleri kullanılarak, PCM'ye dirençli fenotip gösteren en iyi bireysel mutantlar belirlendi. Daha sonra, seçilen mutantlar ve WT, mayalanmış bir ortam elde etmek için logaritmik faza kadar ayrı ayrı DMEM'de büyütüldü. MY2, MP2 ve WT ile mayalanmış DMEM’lerin (WT-DM, MP-DM and MY-DM), PC3 hücreleri üzerindeki etkisini anlamak için oksidatif hasar, apoptotik indeks, hücre göçü ve gen ekspresyon testleri uygulandı. Mevcut çalışmaya göre, evrimsel mühendislikle elde edilen mutant mayaların PCM içindeki büyüme becerisi, WT'ye kıyasla, bariz olarak arttı. Bu çalışma ayrıca, WT-DM, MP-DM ve MY-DM'nin PC3 hücre kültüründe apoptozu indükleyerek hücre büyümesini önemli ölçüde azalttığını göstermiştir. Bununla birlikte, MY-DM; WT-DM ve MP-DM'den farklı olarak, PC3 hücrelerinde apoptozu teşvik etmek için birçok moleküler yolu aynı anda aktive etti. Örneğin artan ROS üretimi, azalan hücre göçü ve apoptotik gen ifadelerinin artan regülasyonu. Diğer yandan ise, MP-DM apoptotik indeksi artırırken, apoptotik gen ekspresyonunu azaltmıştır. Sonuç olarak, mevcut çalışmada PCM'de kısıtlı büyüyen WT yerine, MY2 ve MP2 mutantları başarılı bir şekilde elde edilmiştir. Ayrıca, WT-DM ve MP-DM, MY-DM'nin PC3 hücrelerinde apoptozu uyaran çeşitli etkili metabolitleri içerdiğini de gösterdi.