Glutatyon S-Transferaz (GST) Enziminin Tavuk Yüreğinden Saflaştırılması ve Karakterizasyonu

Abstract

ÖZET: Glutatyon S-transferaz enzimi (GST; EC 2.5.1.18) metabolizmada önemli bir antioksidan enzimdir ve glutatyonun toksisite oluşturabilecek birçok metabolitle konjugasyonunu sağlayan reaksiyonlarda görev alır. Bu tez kapsamında, GST enzimi tavuk yüreğinden homojenatın hazırlanması, amonyum sülfat çöktürmesi ve glutatyon-agaroz afinite kromatografisi vasıtasıyla 9,048 EÜ/mg protein spesifik aktivite ve %40 verimle 20,99 kat saflaştırıldı. Daha sonra enzim saflığının kontrol edilmesi ve alt birim molekül kütlesinin belirlenmesi amacıyla sodyum dodesil sülfat poliakrilamit jel elektroforezi (SDS-PAGE) yapılarak tek bant elde edildi. SDS-PAGE ile saflaştırılan GST enziminin alt birim molekül kütlesi yaklaşık 20,94 kDa olarak bulundu. Saflaştırılan GST enzimi için yapılan karakterizasyon çalışmalarında optimum pH, (Tris-HCI tamponunda) pH= 8,5, optimum iyonik şiddet, (Tris-HCI tamponunda) 0,2 M, stabil pH, (Tris-HCI tamponunda) pH = 8,5 ve optimum sıcaklık 60 oC olarak bulundu. Ayrıca Lineweaver-Burk grafiklerinden faydalanılarak enzime ait KM ve Vmax değerleri sırasıyla GSH substratı için KM, 0,087 mM, Vmax 0,625 EÜ/mL; CDNB substratı için KM, 0,798 mM, Vmax, 1,141 EÜ/ mL olarak hesaplandı.

ABSTRACT: Glutathione S-transferase enzyme (GST; EC 2.5.1.18) is an important antioxidant enzyme in metabolism and takes part in reactions that provide conjugation of glutathione with many metabolites that may cause toxicity. Within the scope of this thesis, the GST enzyme, which has 9,048 EU/mg protein specific activity, was purified 20.99-fold with 40% yield by means of preparation of homogenate from chicken heart, ammonium sulfate precipitation and glutathione-agarose affinity chromatography. Then, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed to control the enzyme purity and to determine the subunit molecular mass, and a single band was obtained. The subunit molecular mass of the GST enzyme purified by SDS-PAGE was found to be approximately 20.94 kDa. In the characterization studies for the additionally purified GST enzyme, optimum pH (in Tris-HCl buffer) pH= 8.5, optimum ionic strength (in Tris-HCl buffer) 0.2 M, stable pH, (in Tris-HCl buffer) pH = 8, 5 and the optimum temperature is 60 oC; also, using Lineweaver-Burk graphs, the KM and Vmax values of the enzyme were determined as KM, 0.087 mM, Vmax 0.625 EÜ/mL for the GSH substrate; For CDNB substrate, KM was calculated as 0.798 mM, Vmax was calculated as 1.141 EU/mL.