Glutatyon S-Transferaz Enziminin Tavuk Karaciğerinden Saflaştırılması Karakterizasyonu ve Bazı Pestisitlerin Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi

Abstract

ÖZET: Bu tez çalışmasında glutatyon S-transferaz enzimi (GST; EC 2.5.1.18) tavuk karaciğerinden amonyum sülfat çöktürmesi ve glutatyon-agaroz afinite kromatografisinden yararlanılarak 8,35 EÜ/mL spesifik aktivitesine sahip olan enzim, %8 verimle 24,56 kat saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin saflığının kontrol edilmesi maksadıyla SDS-PAGE işlemi yapıldı ve tek bant elde edildi. Alt birimin molekül kütlesi yaklaşık olarak 30,9 kDa olarak hesaplandı. Ayrıca enzimin optimum pH değeri (Tris- HCl içinde 8,5); optimum iyonik şiddeti (Tris-HCl ile 150 mM); optimum sıcaklığı (70oC); stabil pH değeri (Tris-HCl ile 8,5) tespit edildi. Enzimin GSH substratı için KM değeri 0,802 mM, Vmax değeri 1,833 EÜ/mL; CDNB için de KM değeri 3,6 mM ve Vmax değeri 2,829 EÜ/mL olarak hesaplandı. Ayrıca malathion WP, deltametrin ve corvette pestisitleri için en az 5 farklı konsantrasyon kullanılarak % Aktivite-[I] grafikleri çizildi ve bu grafiklerin yardımıyla malathion WP, deltametrin ve corvette pestisitleri için IC50 değerleri sırasıyla 0,093, 0,669 ve 0,226 mM olarak bulundu. Daha sonra deltametrin için 5 farklı substrat ve 3 sabit inhibitör konsantrasyonunda Lineweaver-Burk grafiği çizilerek Ki sabiti 0,0258±0,044 mM ve inhibisyon tipi yarışmasız olarak belirlendi.

ABSTRACT: In this thesis, glutathione S-transferase enzyme was purified with a specific activity of 8.35 EU/mL, 24.56 times 8% yield by using (GST; EC 2.5.1.18) ammonium sulfate precipitation and glutathione-agarose affinity chromatography from chicken liver. SDSPAGE was performed to control the purity of the purified enzyme and a single band was obtained. The molecular mass of the subunit was calculated as approximately 30.9 kDa. In addition, the optimum pH value of the enzyme (8.5 in Tris-HCl); optimum ionic strength (150 mM with Tris-HCl); optimum temperature (70oC); stable pH value (8.5 with Tris HCl) was determined. The KM value for the GSH substrate of the enzyme was 0.802 mM, the Vmax value was 1.833 EU/mL; for CDNB, the KM value was calculated as 3.6 mM and the Vmax value was calculated as 2.829 EU/mL. In addition, % Activity- [I] graphs were drawn for malathion WP, deltamethrin and corvette pesticides using at least 5 different concentrations, and with the help of these graphs, IC50 values for malathion WP, deltamethrin and corvette pesticides were found as 0.093, 0.669 and 0.226 mM, respectively. Then, Lineweaver-Burk plot was drawn for deltamethrin at 5 different substrate and 3 fixed inhibitor concentrations, and Ki constant was determined as 0.0258±0.044 mM and inhibition type was found to be non-competitive.