Glutatyon Redüktaz Enziminin Koyun Kalp Dokusundan Saflaştırılması ve Karakterizasyonu

Abstract

ÖZET: Glutatyon redüktaz (GR; E.C.1.8.1.7), GSSG’nin GSH’a indirgenmesini katalizleyen bir enzim olup flav in koenzimi (FAD) ve piridin nükleotid e (NADPH) bağımlı disülfit oksidoredüktaz ailesinin bir üyesi dir . Bu çalışmada glutatyon redüktaz enzimi koyun kalp dokusundan saflaştırıldı. Bu saflaştırma işleminde %30 70 arası amonyum sülfat çöktürmesi ve 2', 5' ADP Sepharose 4B afinite kromatografisi yöntem ler i uygulandı. 5,35 EÜ /mg. protein spesifik aktivitesine sa hip olan GR enzimi %72,82 verimle 191 kat saflaştırıldı SDS PAGE yönte mi ile enzimin saflık derecesi kontrol edildi ve denatüre edici şartlarda molekül kütlesi yaklaşık olarak 70 kDa bulundu Karakterizasyon çalışmalarında ise enzimin optimum pH, stabil p H, optimum iyonik şiddet ve optimum sıcaklık değerleri sırasıyla 6,0 (0,1 M KH 2 PO 4 tamponunda), 8,0 (0,1 M KH 2 PO 4 tamponunda), 240 mM (0,1 M KH 2 PO 4 ) ve 70°C olarak bulundu. Ayrıca NADPH ve GSSG substratları için K M ve V max değerleri için sırasıyla 7,776 mM , 0,1678 EÜ/mL ve 0,593 mM, 0,0306 EÜ/mL olduğu belirlendi.

ABSTRACT: Glutathione reductase (GR; E.C.1.8.1.7) is an enzyme that catalyzes the reduction of GSSG to GSH and is a member of the flavin coenzyme (FAD) and pyridine nucleotide (NADPH) dependent disulfide oxidoreductase family. In this study, glutathione reductase en zyme was purified from sheep heart tissue. In this purification process, 30 70% ammonium sulfate precipitation and 2', 5' ADP Sepharose 4B affinity chromatography methods were applied. GR enzyme, which has a protein specific activity of 5.35 EU/mg, was pur ified 191 fold with a yield of 72.82%. The purity of the enzyme was checked by SDS PAGE method and the molecular mass was found to be approximately 70 kDa under denaturing conditions. In the characterization studies, the optimum pH, stable pH, optimum ioni c strength and optimum temperature values of the enzyme were found to be 6.0 (in 0.1 M KH 2 PO 4 buffer), 8.0 (in 0.1 M KH 2 PO 4 buffer), 240 mM (0.1 M KH 2 PO 4) and 70°C, respectively. In addition, the K M and V max values for NADPH and GSSG substrates were determined to be 7.776 mM, 0.1678 EÜ/mL and 0.593 mM, 0.0306 EÜ/mL, respectively.