GLUTATYON S-TRANSFERAZ ENZİMİNİN KOYUN DALAK DOKUSUNDAN SAFLAŞTIRILMASI VE KARAKTERİZASYONU

Abstract

ÖZET Yüksek lisans tezi olarak sunulan bu çalışmada, mikroorganizmalardan memelilere kadar pekçok organizmada yaygın olarak bulunan ve hücre içi majör antioksidan sistem olan glutatyon (GSH) antioksidan sisteminin önemli enzimlerinden glutatyon S-transferaz (GST; EC 2.5.1.18) sitozolik enzimi koyun dalak dokusundan homojenat hazırlanması, salting out (amonyum sülfat tuzu ile çöktürme yöntemi) ve afinite kromatografisi (glutatyon-agaroz) olmak üzere üç adımda 3.67 EÜ/ mg protein değeri (spesifik aktivite) ile %3.73 verim ile 122.3 kat saflaştırıldı. Koyun dalak dokusundan saflaştırılan GST enziminin saflık derecesini belirlemek ve doğal alt birim molekül kütlelerini tespit etmek amacıyla SDS-PAGE metodu kullanıldı. Koyun dalak dokusu GST enziminin alt birimlerine ait molekül kütlesi SDS-PAGE metodu ile yaklaşık 26.36 kDa olarak hesaplandı. Koyun dalak dokusundan saflaştırılan GST enziminin karakterizasyonu için gerçekleştirilen çalışmalarda; optimum pH, K-fosfat tamponu pH=8.0, optimum aktivite gösterdiği iyonik şiddet, K-fosfat tampon çözeltisi 1.0 M, stabil pH, K-fosfat tampon çözeltisi pH = 7.0 ve optimum sıcaklığı 60 oC olarak bulundu. Koyun dalak dokusundan saflaştırılan GST enzimi için gerçekleştirilen kinetik çalışmalarda enzime ait KM ve Vmax değerleri Lineweaver-Burk grafikleri vasıtasıyla hesaplandı. Enzimin substratları olan GSH için KM değeri 0.629 mM, Vmax değeri 0.056 EÜ/mL; 1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) için KM değeri 0.321 mM, Vmax değeri 0.129 EÜ/mL olarak belirlendi.

ABSTRACT In this study, common in many organisms from microorganisms to mammals the cytosolic enzyme glutathione S-transferase (GST; EC 2.5.1.18), which is one of the important enzymes of the the major intracellular antioxidant system of glutathione (GSH), purified from sheep spleen tissue was used prepare homogenate, salting out method (ammonium sulfate salt precipitation) and affinity chromatography (glutathione-agarose). SDS-PAGE method was used to determine the purity level of the GST enzyme purified from sheep spleen tissue and to determine the natural subunit molecular masses. The molecular mass of the subunits of the sheep spleen tissue GST enzyme was calculated as approximately 26,36 kDa by SDS-PAGE method. In the studies carried out for the characterization of the GST enzyme purified from sheep spleen tissue; optimum pH, K-phosphate buffer pH=8.0, optimum ionic strength, K-phosphate buffer solution 1.0 M, stable pH, K-phosphate buffer solution pH = 7.0 and optimum temperature 60 oC. In the kinetic studies performed for the GST enzyme purified from sheep spleen tissue, the KM and Vmax values of the enzyme were calculated using Lineweaver-Burk graphs. For GSH, which is the substrate of the enzyme, the KM value was 0,629 mM, the Vmax value was 0,056 EU/ mL; The KM value for 1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) was determined as 0,321 mM, and the Vmax value was determined as 0,129 EU / mL.