6-FOSFOGLUKONAT DEHİDROGENAZ ENZİMİNİN JAPON BILDIRCIN (Coturnix coturnix japonica) KARACİĞERIRİNDEN SAFLAŞTIRMASI VE KARAKCİĞERİZASYONOU

Abstract

ABSTRACT In this study, 6-phosphogluconate dehydrogenase (6PGD) enzyme was purified from the quail liver by using ammonium sulphate precipitation, and 2', 5'-ADP Sepharose 4B affinity chromatography methods, with specific activities 14.6 EU/ml, 89% yield and 112 purification fold. Enzyme activity was measured spectrophotometrically at 340 nm. SDS-PAGE checked the purity of the enzyme. The molecular weight of purified enzyme by the SDS-PAGE method was calculated to be 44 KDa. Protein determination was performed by the Bradford method. For the enzyme optimal pH (8.0), stable pH (8.0), optimum ionic strength (600 mM in Tris-HCl) optimal temperature (60°C) were determined. In addition KM and Vmax values for 6-phosphogluconate (6-PGA) and NADP+ were calculated as 0.058 and 0.0015 mM; 0.0078 and 0.057 EU/ml respectively.

ÖZET Bu tez çalışmasında 14,6 EÜ/mg.protein spesifik aktivitesine sahip 6-fosfoglukonat dehidrojenaz (6PGD) enzimi bıldırcın karaciğerinden amonyum sülfat çöktürmesi ve 2', 5'-ADP Sefaroz 4B afinite kromatografisi yöntemleri kullanılarak %89 verimle 112 kat saflaştırıldı. Enzim aktivitesi 340 nm'de spektrofotometrik olarak ölçüldü. Enzimin saflığı SDS-PAGE yöntemiyle kontrol edildi. Saflaştırılan enzimin ait alt birimlerinin molekül kütlesi SDS-PAGE yöntemiyle 44 KDa olarak hesaplandı ve protein tayini Bradford yöntemiyle gerçekleştirildi. Ayrıca enzim için optimum pH (8.0), optimum sıcaklık (60°C), optimum iyonik şiddet (600 mM Tris/HCl), stabil pH (8.0) gibi karakterizasyon çalışmaları yapıldı. İlaveten enzim substratları olan 6-PGA ve NADP+ için KM ve Vmax değerleri sırasıyla 58 ve 0,0015 mM; 0,0078 ve 0,057 EÜ/ml olarak belirlendi.