Althaea officinalis L. BİTKİSİNİN KALLUS KÜLTÜRLERİNE UV UYGULAMASI SONRASINDA ELDE EDİLEN EKSTRAKTLARIN ANTİMİKROBİYAL VE ANTİKANSER AKTİVİTESİNİN ARAŞTIRILMASI

Abstract

ÖZET Malvaceae familyası içerisinde yer alan Althaea officinalis L. alternatif tıpta yaygın olarak kullanılan bir bitkidir. Bu çalışmanın amacı A. officinalis bitkisini in vitro ortamda geliştirip, bitkinin farklı kısımlarını eksplant kaynağı olarak kullanıp, uygun bir kallus rejenerasyon protokolü ouşturduktan sonra, elde edilen kalluslara UV-C uygulamasının ardından, kallusların metanol ve etil asetat ekstraktlarının antimikrobiyal ve antikanser aktivitelerinin araştırılmasıdır. Tohumlarda en etkili sterilizasyonun, %100 oranında, 30 dakika süre ile ticari çamaşır suyunda bekletmek olduğu tespit edilmiştir. Tohumlarda çimlenme güçlüğünün olduğu görülmüş, bu nedenle farklı besin ortamları ve farklı katılaştırıcı maddeler kullanılarak uygun bir çimlenme protokolünün geliştirilmesi amaçlanmıştır. Çimlenme ortamları olarak MS + plant agar, MS + gelrite, Gamborg-B5 + plant agar ve Gamborg-B5 + gelrite kullanılmıştır. En etkili çimlenmenin %28 oranında MS + gelrite kullanılarak hazırlanan besin ortamı olduğu tespit edilmiştir. Steril ortamda çimlendirilen Althaea officinalis L. bitkilerinin yaprak, yaprak sapı ve kök kısımları eksplant kaynağı olarak kullanılmıştır. Eksplantlar farklı dozlarda 2,4- D (1, 2 mg/l) ve BAP (0,25, 0,50,0,75 mg/l) içeren MS besin ortamında kültüre alınmıştır. En etkili kallus gelişim oranı ve kallus ağırlığı, yaprak sapı eksplantlarında, %100 oranında ve 516,24±0,48 mg ağırlığında, 1 mg/l 2,4-D + 0,25 mg/l BAP içeren MS besin ortamında elde edilmiştir. Kallus gelişimi açısından en verimsiz eksplantın kök olduğu gözlenmiştir. Yaprak ve yaprak sapı eksplantlarından elde edilen kalluslar UV-C uygulamasına maruz bırakılmıştır. Metanol ve etil asetat ekstraktlarının 1 mg/ml, 5 mg/ml ve 10 mg/ml konsantrasyondaki çözeltileri hazırlanarak, 7 farklı gram pozitif (Bacillus subtilis ATCC 6337, Brevibacillus brevis, Bacillus megaterium DSM 32, Bacillus subtilis IM 622, Bacillus cereus EMC 19, Staphylococcus aureus 6538 P, Listeria monocytogenes NCTC 5348), 9 farklı gram negatif (Salmonella typhimurium NRRLE 4413, Pseudomonas fluorescens, Enterobacter aerogenes CCM 2531, Klebsiella pneumoniae EMCS, Escherichia coli ATCC 25922, Proteus vulgaris FMC II, Pseudomonas aeruginosa DSM 50070, Proteus vulgaris, Salmonella enterica ATCC 13311) bakteri üzerindeki antimikrobiyal aktivitesi, disk düfüzyon yöntemi kullanılarak araştırılmıştır. Kullanılan her üç ekstrakt konsantrasyonunun antimikrobiyal aktivitelerinin olmadığı belirlenmiştir. Ekstraktlarının SH-SY5Y insan nöroblastoma hücreleri üzerindeki antikanser aktiviteleri araştırılmıştır. Yaprak ve yaprak sapı kalluslarına ait etil asetat ekstraktlarının 1000, 500, 250, 125, 62,5 μg/ml dozlarının antikanser aktivitesinin olduğu, Yaprak ve yaprak sapı kalluslarına ait metanol ekstraktlarının ise kullanılan bütün dozlarda (1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 15,625, 7,8125 μg/ml) antikanser aktivite gösterdiği saptanmıştır.

ABSTRACT Althaea officinalis L., a plant of the Malvaceae family, is widely used in alternative medicine. The aim of this study is to cultivate the A. officinalis plant in vitro, create an appropriate callus regeneration protocol and to investigate the antimicrobial and anticancer activities of methanol and ethyl acetate extracts of calli after UV-C application, using different parts of the plant as an explant source. It is very important to ensure the surface sterilization of the plant material in in vitro studies. For the surface sterilization of the seeds commercial bleach is used for 10, 15, 20, 25, 30 minutes. We found that the most effective sterilization is obtained soaking the seeds in 100% commercial bleach for 30 minutes. We observed that the sterilized seeds have difficulties of germination, so we aimed to develop a suitable germination protocol by using different nutrient media and different solidifying agents. MS + plant agar, MS + gelrite, Gamborg-B5 + plant agar and Gamborg-B5 + gelrite were used as germination media. The most effective germination was seen in the nutrient medium prepared using 28% MS + gelrite. Leaf, petiole and root parts of Althaea officinalis plants germinated in sterile environment were used as explant sources. Explants were cultured in MS medium containing different concentrations of 2,4-D (1.2 mg/l) and BAP (0,25, 0,50, 0,75 mg/l). The most effective callus growth rate and callus weight is observed in petiole explants MS nutrient medium containing 1 mg/l 2,4-D + 0,25 mg/l BAP at a rate of 100% with the weight 516,24±0,48 mg. The most inefficient explant in terms of callus development was the root. Calli obtained from leaf and petiole explants were exposed to UV-C treatment for 15 minutes from a distance of 15 cm. After the UV-C application, the calli were kept in the climate cabinet for 48 hours under suitable conditions.Extractions of calli were carried out using methanol and ethyl acetate solutions. 1 mg/ml, 5 mg/ml and 10 mg/ml solutions of methanol and ethyl acetate extracts were prepared and their antimicrobial activity on bacteria was investigated using the disc diffusion method for 7 different gram-positive (Bacillus subtilis ATCC 6337, Brevibacillus brevis, Bacillus megaterium DSM 32, Bacillus subtilis IM 622, Bacillus cereus EMC 19, Staphylococcus aureus 6538 P, Listeria monocytogenes NCTC 5348) and 9 different gram-negative (Salmonella typhimurium NRRLE 4413, Pseudomonas fluorescens, Enterobacter aerogenes CCM 2531, Klebsiella pneumoniae EMCS, Escherichia coli ATCC 25922, Proteus vulgaris FMC II, Pseudomonas aeruginosa DSM 50070, Proteus vulgaris, Salmonella enterica ATCC 13311 ) bacteria. None of the three extract concentrations used had any antimicrobial activities.The anticancer activities of the extracts on SH-SY5Y human neuroblastoma cells were studied using the WST-1 viability kit. The 1000, 500, 250, 125, 62,5 μg/ml concentrations of ethyl acetate extracts of leaf and petiole calli have anticancer activity. The methanol extracts of leaf and petiole calli have anticancer activity at all concentrations (1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 15,625, 7,8125 μg/ml).